Clonación y caracterización funcional de la enzima L-Galactosa deshidrogenasa de la vía D-Manosa/L-Galactosa de Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh

Abstract

En la amazonía peruana los frutos de Myrciaria dubia, se caracterizan principalmente por su alto contenido de AA, lo cual representa una alternativa para el desarrollo de procesos biotecnológicos de producción de AA. En camu-camu, para la biosíntesis de AA existen 5 vías metabólicas, sin embargo, ninguna de estas vías ha sido caracterizada, ni siquiera parcialmente. Es por ello que se clono y caracterizo funcionalmente a la enzima L- galactosa deshidrogenasa (GDH) de la vía D-manosa/L-galactosa de M. dubia. Para esto se identificó en el transcriptoma de M. dubia la secuencia del gen que codifica la enzima L-galactosa deshidrogenasa, la secuencia fue optimizada y ligada al vector de expresión (pET-TOPO), esta se expresó en Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3). La enzima fue purificada por cromatografía de Afinidad y Exclusión Molecular, eluyendo una molécula con una masa molecular calculada de 38,6 kDa (masa teórica 39,3 kDa), demostrando que la enzima es un monómero en solución. La enzima recombinante L-galactosa deshidrogenasa de M. dubia (MdGDH) mostro actividad frente a L-galactosa en presencia de NAD+, así mismo, presento un Km =0.3533 efecto de una cinética de Michaelis-Menten. Los resultados obtenidos sugieren que L-galactosa deshidrogenasa estaría relacionada con el alto contenido de AA en camu-camu, así mismo, este trabajo proporciona el modelo para realizar los estudios de las otras enzimas que están involucradas en la biosíntesis de AA.

In the Peruvian Amazon, the fruits of Myrciaria dubia are mainly characterized by their high content of ascorbic acid (AA), which represents an alternative for the development of biotechnological processes of AA production. In camucamu, for the biosynthesis of AA there are 5 metabolic pathways, however, none of these pathways has been characterized. Here, we report the study of the enzyme L-galactose dehydrogenase (GDH) of the D-mannose / Lgalactose pathway of M. dubia, that was cloned and functionally characterized. For this, the sequence of the gene encoding the enzyme L-galactose dehydrogenase was identified in the M. dubia transcriptome, the sequence was optimized and insert into the expression vector (pET-TOPO), this was expressed in Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3). The enzyme was purified by affinity and molecular exclusion chromatography, eluting a molecule with a calculated molecular mass of 38.6 kDa (theoretical mass 39.3 kDa), demonstrating that the enzyme is a monomer in solution. The recombinant enzyme L-galactose dehydrogenase of M. dubia (MdGDH) showed activity against L-galactose in the presence of NAD +, likewise, it showed a Km= 0.3533 effect of a Michaelis-Menten kinetics. The results obtained suggest that L-galactose dehydrogenase would be related to the high content of AA in camu-camu, likewise, this work provides the model to perform studies of the other enzymes that are involved in the biosynthesis of AA.