Estandarización de un método de enrequecimiento de ADN genómico de Plasmodium Falciparum

Abstract

Malaria en el Perú es una enfermedad endémica, que constituye un problema de salud pública, principalmente en el departamento de Loreto, el cual concentra altas proporciones de infecciones asintomáticas y submicroscópicas. El objetivo de este trabajo fue estandarizar un método de enriquecimiento de ADN genómico de P. falciparum. Muestras de ADN de P. falciparum de diferentes concentraciones parasitarias fueron enriquecidas a través del método de amplificación selectiva del genoma total (SWGA), utilizando la polimerasa phi29 y los conjuntos de cebadores 6A y 8A previamente reportados. Mediante SWGA se logró incrementar hasta ~ 126 veces (> 5 000 moléculas/μL) el ADN inicial de P. falciparum en muestras clínicas simuladas. El uso de la enzima de restricción FspEI generó un incremento de ~ 38 veces el ADN de P. falciparum y la eliminación total de ADN humano. Se logró incrementar hasta ~ 29 126 veces (> 60 000 moléculas/μL) el ADN inicial de P. falciparum en muestras clínicas de pacientes con malaria. En conclusión, el método SWGA produce el enriquecimiento del ADN de P. falciparum en una amplia gama de concentraciones, a partir de muestras clínicas simuladas y muestras clínicas de pacientes. Finalmente, este trabajo proporciona una herramienta útil a los grupos de investigación de Malaria en la región Loreto, y es elemento importante para realizar diferentes estudios que involucren el ADN de muestras de baja densidad parasitaria.

Malaria in Peru is an endemic disease, which constitutes a public health problem, mainly in the department of Loreto, which concentrates high proportions of asymptomatic and submicroscopic infections. The objective of this work was to standardize a method of enrichment of genomic DNA of P. falciparum. DNA samples of P. falciparum of different parasitic concentrations were enriched through the selective whole genome amplification (SWGA) method, using the phi29 polymerase and the previously reported sets of primers 6A and 8A. Through SWGA, the initial DNA of P. falciparum in simulated clinical samples was increased to ~ 126 times (> 5 000 molecules/μL). The use of the FspEI enzyme generated an increase of ~ 38 times the DNA of P. falciparum and the total elimination of human DNA. The initial DNA of P. falciparum in clinical samples of patients with malaria was increased to ~ 29 126 times (> 60 000 molecules/μL). In conclusion, the SWGA method produces the enrichment of P. falciparum DNA in a wide range of concentrations, from simulated clinical samples and clinical samples of patients. Finally, this work provides a useful tool to the Malaria research groups in the Loreto region, and is an important element to carry out different studies that involve the DNA of samples of low parasitic density.