Expresión y purificación de la enzima dihidrofolato reductasa de tipo salvaje y mutantes de Plasmodium vivax

Abstract

Due to its essential role in nucleotide synthesis, dihydrofolate reductase (DHFR) is a crucial enzyme present in various organisms, ranging from bacteria to mammals, including humans. In malaria-causing parasites, DHFR plays a vital role in parasite survival, contributing to its ability to resist and evade antifolate treatments. Although extensive genetic and enzymatic information is available for Plasmodium falciparum DHFR, data on Plasmodium vivax remain limited. Therefore, the main objective of this study was to standardize a protocol for the expression and purification of wild-type and mutant variants of P. vivax DHFR. Expression vectors carrying the recombinant genes were cloned and expressed in Escherichia coli Rosetta. After enzyme induction, they were purified using standard chromatographic techniques and characterized using spectrophotometric and electrophoretic methods, confirming their monomeric nature (~29 kDa). Affinity chromatography yielded concentrations of 9.93, 8.12, and 10.32 mg/ml, while size-exclusion chromatography produced 8, 7, and 9 mg/ml, resulting in total production of 48, 42, and 54 mg per liter of culture for each variant, respectively. The results demonstrate that the enzymes were successfully expressed and purified, obtaining sufficient quantities of highly pure enzyme. This achievement represents a significant advancement for future structural and functional studies of the enzyme.

Debido a su rol esencial en la síntesis de nucleótidos, el dihidrofolato reductasa (DHFR) es una enzima crucial presente en diversos organismos, desde bacterias hasta mamíferos, incluido el ser humano. En parásitos causantes de la malaria, DHFR desempeña un papel vital en la supervivencia del parásito, contribuyendo a su capacidad para resistir y evadir a los tratamientos con antifolatos. Aunque se ha recopilado una amplia información sobre la DHFR de Plasmodium falciparum a nivel genético y enzimático, los datos disponibles sobre Plasmodium vivax siguen siendo limitados. Por ello, el objetivo general de esta investigación fue estandarizar un protocolo para expresar y purificar la enzima DHFR tipo salvaje y mutantes de P. vivax. Los vectores de expresión que portaban los genes recombinantes fueron clonados y expresados en Escherichia coli Rosetta. Tras la inducción de las enzimas, estas se purificaron mediante técnicas cromatográficas estándar y se caracterizaron con métodos espectrofotométricos y electroforéticos, confirmando su naturaleza monomérica (~29 kDa). Mediante cromatografía de afinidad se obtuvieron concentraciones de 9.93, 8.12 y 10.32 mg/ml y 8, 7 y 9 mg/ml tras exclusión molecular, produciendo 48, 42 y 54 mg/litro de cultivo para cada variante, respectivamente. Los resultados demuestran que las enzimas fueron expresadas y purificadas con éxito, obteniendo cantidades suficientes de enzima con una alta pureza. Este logro constituye un avance importante para futuros estudios estructurales y funcionales de la enzima.