Caracterización biofísica y funcional de una fosfolipasa del veneno bruto de Bothrops atrox (familia: viperidae) “jergón”, Loreto-Perú

Abstract

Snakebite accidents represent a serious public health problem in the Amazon region, with Bothrops atrox being the main cause of most cases. The lack of detailed studies on the isoforms of PLA2 in Bothrops atrox highlights the need for specific investigations to better understand their role in venom toxicity and their potential for therapeutic applications. In this study, we isolated and characterized a PLA2 isoform from the crude venom of Bothrops atrox. The crude venom was purified through two purification stages, and the enzymatic activity of PLA2 was determined. Advanced biophysical characterization techniques, such as mass spectrometry, dynamic light scattering (DLS), SEC MALS, and circular dichroism (CD), were used to determine the molecular mass, size, oligomeric state, purity, thermal stability, and secondary structure of the enzyme. Additionally, protein crystallization experiments were performed. An acidic PLA2 isoform was isolated and purified with a yield of 5% from the crude venom, showing high catalytic activity, with an optimal concentration of 6.25 µg for the degradation of lipoproteins. Biophysical characterization indicated that PLA2 has a dimeric oligomeric state and is highly thermostable, with a transition temperature of 58°C. Crystallization attempts resulted in low-resolution crystals, preventing the determination of a detailed crystallographic model. This study establishes a solid foundation for subsequent investigations into the development of antivenoms and future understanding of the functional and structural diversity of PLA2s from Bothrops atrox.

Accidentes ofídicos implican un grave problema de salud pública en la región amazónica, con Bothrops atrox protagonista de la mayoría de los casos. La falta de estudios detallados sobre las isoformas de PLA2 en Bothrops atrox resalta la necesidad de investigaciones específicas para entender mejor su papel en la toxicidad del veneno y su potencial para aplicaciones terapéuticas. En este estudio, aislamos y caracterizamos una isoforma de PLA2 a partir del veneno bruto de Bothrops atrox. Para ello, se purificó el veneno bruto mediante dos etapas de purificación y determinó la actividad enzimática de la PLA2. Se emplearon técnicas avanzadas de caracterización biofísica, como espectrometría de masas, dispersión de luz dinámica (DLS), SEC-MALS y dicroísmo circular (CD) para determinar la masa molecular, el tamaño, el estado oligomérico, la pureza, la estabilidad térmica y la estructura secundaria de la enzima. Además, se realizaron experimentos de cristalización de la proteína. Se aisló y purificó una isoforma ácida de PLA2 con un rendimiento del 5% a partir del veneno bruto, mostrando una alta actividad catalítica, con una concentración óptima de 6.25 µg para la degradación de lipoproteínas. La caracterización biofísica indicó que la PLA2 tiene un estado oligomérico dimérico y es altamente termoestable, con una temperatura de transición de 58°C. Los intentos de cristalización resultaron en cristales de baja resolución, lo que impidió la determinación del modelo cristalográfico detallado. Este estudio establece una base sólida para investigaciones subsiguientes para el desarrollo de antivenenos y percepción futura de la diversidad funcional y estructural de las PLA2 de Bothrops atrox.